Az eltelt időszak alatt az időjárás kedvezően alakult, először a gombák elszaporodására alkalmas hűvös napok jöttek, majd ezt követték a baktériumok számára megfelelőbb meleg napok. Az újra munkához látó Fleming észrevette, hogy a gombatelep környékén a baktériumtelep átlátszóvá vált, mintha feloldódtak volna a Staphylococcusok. Mint kiderült, valamilyen, a gombákból származó anyag teljesen elpusztította a környező területeken élő baktériumokat.

Az elkövetkező hónapokban Fleming számos kísérletet végzett az általa penicillinnek elkeresztelt erősen antibakteriális hatású anyaggal. Kiderítette, hogy a felfedezett anyag sok bakteriális eredetű betegség kórokozóját ugyanúgy elpusztítja, mint a Staphylococcusokat, ugyanakkor nem zavarja a fehérvérsejtek normális működését. Az új anyaggal kapcsolatos kutatásai rámutattak, hogy az nem károsítja az egészséges szervezetet, továbbá, hogy nem minden baktériumra van végzetes hatással, mely tulajdonsága lehetővé teszi ezen baktériumok izolálását. Flemingnek és munkatársainak azonban nem sikerült magát a hatóanyagot kivonniuk a gombatelep által termelt anyagból, s emiatt a penicillin átütő sikere az 1940-es évekig váratott magára, gyógyító tulajdonságát csupán ekkor fejthette ki először.

Az ausztrál Howard Florey és a náci Németországból emigrált Ernst Chain voltak az elsők, akiknek sikerült a penicillint koncentrált és tisztított formában előállítaniuk. A két tudós ezután 1940. május 25-én nyolc fertőzött egéren, majd a következő év januárjában immár emberen is kipróbálta az új szert. A kísérletek teljes sikert hoztak, s így elhárult a tömeggyártás elől az utolsó akadály, amire a már javában dúló háború miatt is nagy szükség volt. A penicillint eleinte kizárólag a szövetséges csapatok katonái kaphattak, s csak a háború vége felé, illetve utána jutottak hozzá az amerikai civilek is.